Генетикалық зерттеулерді жүргізу барысында біз көбінесе ауыз қуысының кішкентай анатомиялық ісіктерін, тіпті бір жасушалы үлгілерді және адам жасушаларында өте төмен деңгейде транскрипцияланған ерекше гендік мутация үлгілерін зерттеу үшін жеткіліксіз РНҚ үлгілерін кездестіреміз.Әрине, COVID-19 сынағы үшін, егер тампондар дұрыс жерде болмаса немесе сынама алу кезінде жеткілікті уақыт болмаса, сынама мөлшері өте төмен болады, сондықтан Денсаулық сақтау және отбасын жоспарлау комиссиясы екі күн бұрын шықты және сынақтан өтті, ал нуклеин қышқылының сынама алушысы алты үлгіні алмаса, ол туралы хабарлауға болады.
Реагенттің сезімталдығы маңызды, себебі бізде осы немесе басқа мәселе бар, сондықтан RT-ПТР сезімталдығын жақсарту үшін не істей аламыз?
Ықтимал шешімдерді талқыламас бұрын, біз атап өткен жағдайдың екі үлкен асқынуын атап өтейік.
Ең алдымен, біз үлгіде бірнеше жасуша популяциясы болған кезде РНҚ жоғалуы туралы алаңдаймыз.Баған әдісі немесе нуклеин қышқылын тұндыру әдісі сияқты дәстүрлі бөлу және тазалау әдістері қолданылса, бірнеше үлгілердің жоғалу ықтималдығы жоғары.Шешімдердің бірі - тРНҚ сияқты тасымалдаушы молекуланы қосу, бірақ сонда да біздің қалпына келтіру экспериментінің дұрыс екеніне кепілдік жоқ.
Олай болса, қандай жақсы жол бар?Өсірілген жасушалар немесе микроанатомиялық үлгілер үшін жақсы нұсқа тікелей лизисті пайдалану болып табылады.
Идеясы: жасушаларды 5 минутқа бөліп, РНҚ-ны ерітіндіге босату, содан кейін реакцияны 2 минутқа тоқтату, содан кейін РНҚ жоғалмауы үшін лизатты тікелей кері транскрипция реакциясына қосу және соңында алынған кДНҚ-ны тікелей қою. нақты уақыттағы реакцияға.
Бірақ егер шектеулі бастапқы нүкте немесе мақсатты ген экспрессиясының аз мөлшеріне байланысты біз барлық РНҚ-ны қайта өңдей аламыз және әлі де нақты уақытта жақсы сигнал алу үшін жеткілікті үлгілерді қамтамасыз етпесек ше?
Бұл жағдайда алдын ала күшейту қадамы өте пайдалы болуы мүмкін.
Төменде кері транскрипциядан кейін сезімталдықты арттыру схемасы берілген.Бастамас бұрын, алдын ала күшейту үшін осы мақсаттарға арнайы праймерлерді жобалау үшін біз қай нысандарды қызықтыратынымызды сұрауымыз керек.
Бұған 100 жұпқа дейін праймер және 10-14 рет реакция циклі бар аралас праймер жасау арқылы қол жеткізуге болады.Сондықтан, алынған cDNA-ны алдын ала күшейту үшін осы талап үшін арнайы әзірленген Мастер-микс қажет.
Циклдердің санын 10 мен 14 арасында орнатудың себебі - бұл шектеулі циклдар саны әртүрлі мақсаттар арасындағы кездейсоқтықты қамтамасыз етеді, бұл сандық молекулалық ақпаратты қажет ететін зерттеушілер үшін өте маңызды.
Алдын ала күшейтуден кейін біз cDNA-ның үлкен көлемін ала аламыз, осылайша артқы жағындағы анықтау сезімталдығы айтарлықтай жақсарады және біз тіпті үлгіні сұйылтып, ықтимал кездейсоқ қателерді жою үшін нақты уақыттағы бірнеше ПТР реакцияларын орындай аламыз.
Жіберу уақыты: 2023 жылдың 11 сәуірі